自誘導(dǎo)培養(yǎng)基(lac啟動子)(Auto-induction Medium)產(chǎn)品及特點
本產(chǎn)品是在pET專用生長培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上開發(fā)而成的,它利用E.coli自身對培養(yǎng) 基中碳源和能源的調(diào)控利用機制,實現(xiàn)外源蛋白在細(xì)菌達(dá)到飽和期后的自動誘發(fā)。
具有下列特點:
1. 不需添加任何IPTG或相關(guān)誘導(dǎo)物,節(jié)約成本。
2. 免去了密切監(jiān)控菌液密度的過程,尤其適合大規(guī)模篩選 。
3. 細(xì)菌生長密度遠(yuǎn)高于IPTG誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng) 。
4. 外源蛋白表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于IPTG誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。
5. 本產(chǎn)品即開即用,操作簡單 。
6. 與各種細(xì)胞培養(yǎng)容器兼容(如培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)罐、深孔管、發(fā)酵罐等)。

自誘導(dǎo)培養(yǎng)基(lac啟動子)(Auto-induction Medium)操作步驟

(一)獲得目的基因

1、通過PCR方法:以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板,按基因序列設(shè)計一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點),PCR循環(huán)獲得所需基因片段。

2、通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。

(二)構(gòu)建重組表達(dá)載體

1、自誘導(dǎo)培養(yǎng)基(lac啟動子)(Auto-induction Medium)載體酶切:將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(同引物的酶切位點)進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

(三)  獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種

1、 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,根據(jù)重組載體的標(biāo)志(抗Amp或藍(lán)白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質(zhì)粒,雙酶切初步鑒定。

2、 測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆,重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。

3、 以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。

(四)誘導(dǎo)表達(dá)

1、 自誘導(dǎo)培養(yǎng)基(lac啟動子)(Auto-induction Medium)挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養(yǎng)。

2、按1∶50比例稀釋過夜菌,一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中, 37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大約需3hr)。

3、取部分液體作為未誘導(dǎo)的對照組,余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM作為實驗組,兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。

4、分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收獲沉淀,用100μl 1%SDS重懸,混勻, 70℃10min。

5、離心12000g×1min,取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。

自誘導(dǎo)培養(yǎng)基常見種類