懸浮細胞總是在孵抗體和洗的時候被沖掉,懸浮細胞做免疫熒光怎么固定?
傳統(tǒng)方法
實驗步驟:
1. 細胞在冰浴中冷卻,然后用臺式離心機于4℃以800 g 離心5 min,吸去培養(yǎng)液并以4℃PBS重懸細胞。
2. 離心吸去PBS,以1~2 ml 2%PFA固定液,或2%PFA固定液/0.1% Triton X-100重懸細胞,置冰上固定30 min。
3. 離心、吸去固定液,用15 ml 4℃ PBS重懸細胞,放5 min 后,用PBS再次洗滌細胞。
4. 稀釋的第一抗體于4℃用微量離心機以13 500 g 離心2 min,250 μl 抗體足夠用于5x106細胞。
5. 離心細胞,吸去PBS,重懸細胞于第一抗體中,置4℃溫育1 h。
6. 用4℃ PBS稀釋細胞和抗體至15 ml。
7. 離心,吸去PBS,以4℃ PBS重懸細胞,重復1次。
8. 第二抗體4℃用微量離心機以13 500 g 離心2 min,5x106細胞用250 ul 抗體足夠。
9. 吸去PBS,以第二抗體重懸細胞,4℃溫育1 h,重復步驟6及步驟7。
10. 除非立即觀察細胞,否則在進行細胞濃縮的下一步操作之前應以鋁萡包裹離心管并冷藏。
11. 離心細胞并以少量PBS重懸(勿用水),將細胞懸液滴于多聚-L-賴氨酸覆層的載玻片上,加上蓋玻片,盡可能馬上觀察結(jié)果。
鏡下觀察:沒有細胞,原來掉片了?。?!
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